В молекулярной биологии хороший выбор буфера и подготовка к различным этапам выделения ДНК может быть различием между переходом к экспрессии белка или открытием другого набора макси-препарирования для начала. Несмотря на их решающее значение, буферные рецепты часто являются просто рецептами, написанными без объяснения или обоснования для различных компонентов. Одним из таких буферов является буфер глюкоза-трис-ЭДТА или GTE.
$config[code] not foundДля чего используется GTE?
GTE используется для ресуспендирования осадка бактериальных клеток перед лизированием (взломом) клеток и сбором плазмидной ДНК внутри. Лизоцим, который смягчает клеточные мембраны, часто добавляют вместе с буфером GTE. Достижение гомогенной суспензии целых клеток на этом этапе, чтобы впоследствии добавленный раствор лизиса мог попасть во все клетки, является ключом к получению хорошего выхода ДНК. GTE предназначен для этого, одновременно обеспечивая стабильную среду для ДНК.
Глюкоза для осмолярности
50 мМ (миллимолярный) глюкозный сахар добавляют в буфер GTE для поддержания осмолярности, когда концентрация растворенного вещества вне клеток близка к концентрации внутри клеток. Это предотвращает преждевременный лизис клеток, что может привести к снижению выхода ДНК из-за агрегации и деградации. Другие компоненты буфера также вносят вклад в осмолярность раствора, но глюкоза, будучи неэлектролитом, является хорошим выбором, поскольку она не влияет на буферные свойства раствора.
Трис для рН-стабильности
Трис - это короткое название трис (гидроксиметил) аминометана, который является очень распространенным буфером рН. В случае GTE-буфера кислотную соль (трис-HCl) добавляют в буфер в концентрации 25 мМ. Это поддерживает pH раствора на уровне, близком к физиологическому 8,0, что является идеальным значением для предотвращения кислотного гидролиза (деградации) плазмидной ДНК и нежелательных побочных реакций других компонентов клетки.
ЭДТА предотвращает деградацию ДНК
ЭДТА, или этилендиаминтетрауксусная кислота, улавливает или «хелатирует» ионы металлов из раствора, предотвращая их участие в нежелательных побочных реакциях. В буфере GTE добавляется EDTA при 10 мМ. Его основная цель заключается в буфере для округления свободного цинка, магния и кальция, тем самым предотвращая деградацию ДНК некоторыми путями, которые требуют этих металлов.
Некоторые важные советы
Держите буфер GTE холодным и делайте его в небольших количествах, чтобы предотвратить рост непреднамеренных бактерий в нем. Сахар и контролируемый уровень pH обеспечивают отличную питательную среду. Всегда используйте очищенную воду. Водопроводная вода может иметь избыток ионов металлов из труб, что может подавить способность ЭДТА захватывать. Если вы подозреваете наличие мешающей РНК в вашем образце, добавьте РНКазу А в концентрации 100 мкг на миллилитр в буфер GTE, чтобы устранить проблему.
